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      抗體常見問題之WB

      問題 原因 解決方案
      條帶形狀不好看 凝的不均勻,聚合不好 灌膠前將溶液充分混勻
      上樣齒扭曲使上樣孔大小不一 上樣前用針頭將齒撥正,注意不要將針頭插入膠內
      某些樣品鹽濃度較高 除鹽或將樣品鹽濃度調成一致
      每孔上樣量不一致 調整上樣量使基本一致
      緩沖液陳舊,成分改變 重配
      凝膠下面有氣泡 電泳前先將氣泡趕走
      電泳時溫度過高 降低電流或電壓
      目的蛋白信號弱 樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低 加大上樣量或濃縮樣品
      轉膜效率低 以下單列
      抗體濃度低 增加抗體濃度或延長孵育時間
      顯色劑底物濃度不足 增加顯色劑用量
      顯色劑失效 更換顯色劑(吸取A、B液的槍頭不可混用)
      顯色或曝光時間不足 延長顯色或曝光時間
      轉膜效率低 轉膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點相近 提高轉膜緩沖液pH值
      凝膠與膜之間存在氣泡 轉膜前要排盡氣泡
      凝膠與轉印膜兩側濾紙大面積接觸 濾紙、轉印膜和凝膠大小要基本一致,避免濾紙直接接觸
      轉印膜種類選擇不當 使用質量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜
      電壓或電流過小 濕轉時20mA恒流,半干轉時25V左右恒壓
      轉印時間過長或過短,蛋白還在凝膠中或穿透轉印膜 先電泳,根據蛋白大小及轉印裝置選擇合適的轉印時間
      濕轉過程中環境溫度過高 使用預冷的轉膜緩沖液或將裝置至于4度
      顯色或曝光后無條帶 膠與膜方向反了 轉膜時應依次放好PDVF膜與凝膠所對應的電極,即凝膠對應負極,PDVF膜對應正極。
      選用的一抗、二抗及顯色方法不合適 選擇合適的一抗、二抗和顯色方法
      目的蛋白含量低于檢測下限 加大上樣量或濃縮樣品
      抗體效價過低 增加抗體濃度
      抗體孵育時間不足 延長孵育時間,37°C孵育1小時以上
      抗體過度洗滌 減少洗滌時間及次數
      加入HRP底物反應與曝光檢測之間間隔時間過長 反應3到5分鐘及時檢測
      背景過高 封閉物用量不足 提高封閉物濃度,孵育時保證封閉液完全浸沒轉印膜
      封閉物使用不當 檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉
      封閉時間不夠 室溫37度封閉1小時以上,4度封閉過夜
      抗體非特異性結合 降低抗體濃度,減少孵育時間
      抗體濃度過高或洗滌不夠 降低抗體濃度,增加洗滌次數和時間
      化學顯色底物過多 按說明書加入適量的顯色底物
      雜帶 雜蛋白多 處理目的蛋白
      抗體特異性不強 使用特異性強的抗體
      抗體孵育時間過久 減少抗體孵育時間
      二抗與抗原有交叉反應 選擇合適的封閉物
      底物顯色與曝光時間長了 縮短顯色及曝光的時間
      大分子量WB 膜孔徑太小 更換孔徑較大的膜
      轉膜電壓電流低 提高電壓/電流
      轉膜時間短 延長轉膜時間
      膠濃度太大 使用低濃度的膠
      轉膜緩沖液配方不合適 調整轉膜緩沖液中甲醇及SDS濃度


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